熒光是一種分子現(xiàn)象，其中一種物質(zhì)吸收特定顏色的光，并幾乎同時(shí)輻射出另一種顏色的光。后者的能量更低，波長(zhǎng)更長(zhǎng)，這個(gè)過(guò)程被稱為激發(fā)和發(fā)射。許多物質(zhì)都具有熒光特性，包括有機(jī)物和無(wú)機(jī)物。在熒光顯微鏡的早期使用中，顯微鏡學(xué)家觀察的是初級(jí)熒光或自體熒光。但是現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)出許多熒光染料，它們可以發(fā)出非常明亮的熒光，并用于染色樣品的特定部分。這種方法被稱為次級(jí)或間接熒光。這些染料被稱為熒光染料，當(dāng)它們與抗體、核酸等其他有機(jī)活性物質(zhì)結(jié)合時(shí)，也被稱為熒光探針或熒光團(tuán)?，F(xiàn)在已經(jīng)有許多熒光染料在藍(lán)色、綠色、橙色、紅色和近紅外光譜范圍內(nèi)具有特定的輻射峰值。

01 熒光的分子機(jī)理

熒光過(guò)程分為三個(gè)階段，所有這些事件都發(fā)生在相隔幾個(gè)數(shù)量級(jí)的時(shí)間尺度上。進(jìn)入光子對(duì)敏感分子的激發(fā)發(fā)生在飛秒內(nèi)，而激發(fā)態(tài)電子振動(dòng)弛豫到最低能級(jí)的速度要慢得多，可以在皮秒內(nèi)測(cè)量。最后的過(guò)程，即發(fā)射較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子和分子返回基態(tài)，發(fā)生在相對(duì)較長(zhǎng)的納秒時(shí)間內(nèi)。因?yàn)榧ぐl(fā)態(tài)也可以通過(guò)不涉及光發(fā)射的其他非輻射機(jī)制來(lái)弛豫，與熒光發(fā)射競(jìng)爭(zhēng)并降低其效率，所以熒光與用于產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的光子能量相比，熒光光子的能量較低。

02 熒光染料

熒光染料（或熒光團(tuán)）是一種熒光化合物，可以在光激發(fā)下重新發(fā)光。熒光染料通常包含多個(gè)組合的芳香族基團(tuán)，或具有多個(gè) π 鍵的平面或環(huán)狀分子。

熒光染料有時(shí)單獨(dú)使用，作為液體中的示蹤劑、作為某些結(jié)構(gòu)染色的染料、作為酶的底物或作為探針或指示劑（當(dāng)其熒光受到極性或離子等環(huán)境因素的影響時(shí)）。它們通常與大分子共價(jià)鍵合，用作親和或生物活性試劑（抗體、肽、核酸）的標(biāo)記。熒光染料主要用于在熒光成像中對(duì)組織、細(xì)胞或材料進(jìn)行染色。熒光素通過(guò)其胺反應(yīng)性異硫氰酸酯衍生物異硫氰酸熒光素 (FITC) 成為最流行的熒光染料之一。得益于羧基熒光素 (FAM)、TET 等，應(yīng)用已從抗體標(biāo)記擴(kuò)展到核酸。另外其他常見的熒光染料還有羅丹明 (TRITC)、香豆素和花青的衍生物。新一代熒光染料通常表現(xiàn)更好，比傳統(tǒng)染料更耐光、更亮和/或?qū)?pH 值不敏感。以后有機(jī)會(huì)我們會(huì)專門詳細(xì)來(lái)講解熒光染料。

03 熒光光譜

熒光染料的熒光光譜是用熒光光譜儀（熒光分光光度計(jì)）測(cè)量得到的。

確定特定熒光染料的發(fā)射光譜時(shí)，需要確定最大吸收波長(zhǎng)（常等同于最大激發(fā)波長(zhǎng)）并在該波長(zhǎng)下激發(fā)該熒光染料。上圖a中顯示了一個(gè)典型熒光染料的吸收光譜，縱坐標(biāo)為吸收的相對(duì)強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)。然后，我們用一個(gè)單色器（一種僅允許窄光波段通過(guò)的裝置）進(jìn)行掃描，得到全范圍發(fā)射波長(zhǎng)下相對(duì)應(yīng)的熒光發(fā)射強(qiáng)度值。上圖b中顯示了基于各波長(zhǎng)下熒光相對(duì)強(qiáng)度的測(cè)量值繪制的發(fā)射光譜。確定特定熒光染料的激發(fā)光譜時(shí)，也采用了類似的方法，即在用一組連續(xù)的波長(zhǎng)激發(fā)熒光基團(tuán)的同時(shí)，監(jiān)測(cè)不同波長(zhǎng)下的最大熒光發(fā)射強(qiáng)度。確定最大熒光發(fā)射強(qiáng)度，并只允許最大熒光發(fā)射強(qiáng)度對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的發(fā)射光通過(guò)檢測(cè)器。在各激發(fā)波長(zhǎng)下（通常通過(guò)單色器）誘導(dǎo)激發(fā)，并測(cè)量作為波長(zhǎng)函數(shù)的發(fā)射熒光強(qiáng)度。測(cè)量結(jié)果可繪制為如上圖a所示的圖形或曲線，描繪了全范圍激發(fā)波長(zhǎng)光譜相對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度。

在熒光顯微鏡中，激發(fā)和發(fā)射強(qiáng)度與波長(zhǎng)的重疊區(qū)域（如上圖c所示）必須通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)濾光片、分光鏡（反射光熒光）和發(fā)射濾光片來(lái)消除。否則，激發(fā)光太亮?xí)谏w較弱的熒光發(fā)射光，從而顯著降低標(biāo)本的對(duì)比度。

04 熒光信號(hào)強(qiáng)度的影響因素

在給定的激發(fā)強(qiáng)度下，熒光染料所發(fā)射的熒光量受多個(gè)因素影響，其中包括：

1. 樣品染色部分內(nèi)的染料濃度和樣本的厚度。

2. 染料的消光系數(shù)；消光系數(shù)告訴我們有多少入射光會(huì)被給定濃度的染料和給定厚度的樣品所吸收，反映的是波長(zhǎng)相關(guān)的吸收特性，由熒光染料的激發(fā)光譜表示。雖然許多熒光染料在峰值激發(fā)波長(zhǎng)時(shí)有很高的激發(fā)系數(shù)，但實(shí)際的試樣制備技術(shù)往往會(huì)限制試樣中容許的最大濃度，染色標(biāo)本實(shí)際吸收的總光量因而會(huì)減少。

3. 染料的量子效率；量子效率指吸收的光能與發(fā)射的熒光之比，它決定吸收的光能中有多少會(huì)轉(zhuǎn)化為熒光。常見的最有效熒光染料的量子效率約為0.3，但實(shí)際值可能會(huì)因?yàn)樗^淬滅過(guò)程而降低，其中一種是光致漂白。這些因素的結(jié)合，加之許多試樣的受染材料量在觀察視場(chǎng)中非常少，使得典型應(yīng)用中的發(fā)射熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度之比在10-4(極高熒光度樣本)至10-6之間。現(xiàn)行技術(shù) (如熒光原位雜交)使用非常少的熒光材料量，該比值可能低至10-9至10-10。

4. 顯微鏡視場(chǎng)內(nèi)實(shí)際存在的受染材料量。

因此，為了能以足夠高的對(duì)比度看清熒光圖像，熒光顯微鏡必須能夠在不衰減熒光信號(hào)的情況下，將激發(fā)光衰減高達(dá)10-11(針對(duì)非常微弱的熒光)。

05 熒光顯微鏡中的濾光片

熒光顯微鏡的主要濾光元件是位于熒光濾色塊中的三片濾光片：激發(fā)濾光片、發(fā)射濾光片和二向色分光鏡。

1. 激發(fā)濾光片：只透射照明光中能夠有效激發(fā)特定染料發(fā)出熒光的光，濾色塊一般根據(jù)激發(fā)濾光片的類型命名:

U 用于DAPI和Hoechst 33342等染料的紫外激發(fā)；

B 用于FITC和相關(guān)染料的藍(lán)光激發(fā)；

G 用于TRITC、Texas Red等染料的綠光激發(fā)。

2. 發(fā)射濾光片：衰減激發(fā)濾光片所透射的所有光線并非常有效地透射樣品所發(fā)射的任何熒光。這種光的波長(zhǎng)通常大于激發(fā)顏色。它可以是帶通濾光片或長(zhǎng)通濾光片。

3. 二向色分光鏡：一片玻璃組件，與顯微鏡的光路成45度角。這種具有反射一種顏色 (激發(fā)光) 而透射另一種顏色 (發(fā)射熒光)的獨(dú)特能力。目前的二向色分光鏡具有非常高的效率，激發(fā)光的反射效率高于95%，發(fā)射光的透射效率約為95%。這是一個(gè)巨大的進(jìn)步。二向色分光鏡玻璃(稱為基片)通由低自體熒光材料構(gòu)成，如UV熔融石英。大多數(shù)顯微鏡具有一個(gè)滑塊或轉(zhuǎn)臺(tái)，可以容納兩個(gè)到四個(gè)濾光塊或更多。必須注意，各濾光塊中的濾光片是相互匹配的一套組件，應(yīng)當(dāng)避免混用濾光片和分光鏡，除非知道各濾光片組的全部光譜特性。

我們經(jīng)常用U、B和G等顏色激發(fā)光名稱來(lái)簡(jiǎn)單描述濾光片組，但當(dāng)涉及到用于非常見染料和探針的特殊濾光片組時(shí)，這些就不能滿足了，這時(shí)一些用于更精確描述濾光片的參數(shù)的信息是必須的。濾光片有帶通和長(zhǎng)通之分，人所感知的熒光顏色同時(shí)取決于帶寬和特定波長(zhǎng)。

以下我們簡(jiǎn)單介紹一下熒光濾光片中的一些術(shù)語(yǔ)：

帶通濾光片用中心波長(zhǎng) (CWL) 和帶寬 (FWHM) 表示。中心波長(zhǎng)(CWL)為50%峰值透射時(shí)波長(zhǎng)的算術(shù)波長(zhǎng)(納米)平均值。FWHM為50%峰值透射時(shí)（全高半寬）的帶寬。長(zhǎng)通濾光片(LP) 用50%峰值透射時(shí)的開啟或截止波長(zhǎng)表示。

濾光片透過(guò)率指得對(duì)目標(biāo)波段的透光能力，用百分比來(lái)表示，透射率越大，代表透光能力越好。最直接的好處就是有效增加熒光圖像絕對(duì)亮度，保證樣品被充分探測(cè)到。

濾光片衰減水平（也稱為截止深度）一般用光學(xué)密度（OD）單位來(lái)表示：OD=-log(Transmission)，指截止范圍內(nèi)的波長(zhǎng)所對(duì)應(yīng)的透過(guò)率，用來(lái)描述濾光片截止程度，透光率想要達(dá)到0是不可能的，只能讓濾光片的透過(guò)率接近于零，才能夠更好的截止不想要的光譜。

熒光染料發(fā)射熒光亮度相比于激發(fā)光亮度的微乎其微，二者共存于測(cè)試樣品中，我們要檢測(cè)到熒光信號(hào)，需要把較強(qiáng)激發(fā)光充分截止到低于熒光亮度的水平。為提高熒光檢測(cè)準(zhǔn)確度，通常需要將隔離度提高到OD5以上，才能得到較好的成像效果。對(duì)于一些弱熒光成像領(lǐng)域（如熒光原位雜交）則需要OD6甚至以上水平的濾光片。

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