顯微鏡涵蓋許多應(yīng)用，其中包括從生命科學(xué)的基本應(yīng)用到高度發(fā)展成熟的技術(shù)，使用特定的顯微鏡相機(jī)就可以檢測(cè)和定位數(shù)量極少的光子或單個(gè)分子。

在選擇適用于顯微鏡的相機(jī)時(shí)，既要考慮特定的芯片屬性和相機(jī)的有關(guān)方面，也要考慮科學(xué)、醫(yī)療或工業(yè)領(lǐng)域中所需應(yīng)用的需求，您需要在這兩者之間達(dá)到平衡，這一點(diǎn)非常重要。

靶面尺寸和分辨率

顯微鏡相機(jī)靶面尺寸往往越大越好，但隨著靶面尺寸的增加往往會(huì)導(dǎo)致總成本增加。

顯微鏡相機(jī)最終的光學(xué)分辨率取決于光電二極管的數(shù)量和它們相對(duì)于顯微鏡光學(xué)透鏡系統(tǒng)投射到成像陣列表面上圖像尺寸的函數(shù)所決定，當(dāng)前可用的CCD陣列隨著尺寸的變化，從幾百至數(shù)千像素。在顯微鏡這一類受限于衍射的光學(xué)儀器中，當(dāng)使用數(shù)值孔徑為1.4的物鏡時(shí)，在平均可見光波長(zhǎng)（550納米）處的光學(xué)分辨率的阿貝極限為0.2微米。在這種情況下，根據(jù)奈奎斯特采樣定律，當(dāng)像元尺寸大于21μm的一半，即11μm時(shí)，相機(jī)無(wú)法分辨出相距21μm的兩個(gè)物體；當(dāng)像元尺寸小于11μm時(shí)，可以分辨。盡管CCD成像傳感器中更小的光電二極管可以提高空間分辨率，但同時(shí)它們也限制了設(shè)備的動(dòng)態(tài)范圍。

在用顯微鏡觀察時(shí)，圖像通常由光學(xué)系統(tǒng)投影到探測(cè)器表面，該探測(cè)器可以是人眼的視網(wǎng)膜或者電圖像傳感器。為了優(yōu)化所得到的圖像的信息內(nèi)容，探測(cè)器的分辨率必須與顯微鏡的分辨率緊密匹配。

由于芯片在成像系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，因此在選擇芯片時(shí)充分考慮特定的性能規(guī)格是非常重要的

黑白或彩色相機(jī)

黑白相機(jī)由于其量子效率更高，業(yè)界青睞于將它用于熒光應(yīng)用。彩色相機(jī)的量子效率低于黑白相機(jī)——導(dǎo)致出現(xiàn)這種差異的技術(shù)因素在于彩色相機(jī)中每個(gè)像素上的拜耳微型濾色片只能讓特定的波長(zhǎng)通過(guò)。這種過(guò)濾機(jī)制是為了使用“去拜耳化”的過(guò)程來(lái)計(jì)算圖像的顏色信息。由于濾色片會(huì)阻擋一定量的光，因此到達(dá)像素的光子反應(yīng)區(qū)域的光子會(huì)有所減少。除了芯片上的拜爾濾色片結(jié)構(gòu)外，彩色相機(jī)中的紅外截止濾光片也起到限制光線通過(guò)的作用，因?yàn)樗€可阻擋約650 - 700 nm以上的光線。

通常，我們會(huì)使用黑白相機(jī)在多張單獨(dú)圖像中制作出具有多個(gè)熒光標(biāo)記的圖像，以便用于進(jìn)行特定的檢測(cè)以及共定位目標(biāo)分子。通過(guò)不同的可選光源和濾光片組，可以為所用的每種熒光基團(tuán)提供正確的熒光激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)組合。但是，某些應(yīng)用可能會(huì)要求僅使用一臺(tái)相機(jī)在一臺(tái)儀器內(nèi)進(jìn)行彩色成像和熒光處理。如果熒光應(yīng)用對(duì)靈敏度的要求不是太高，這個(gè)要求是可以實(shí)現(xiàn)的。

全局快門和滾動(dòng)快門

CCD芯片只有全局快門一種快門類型，而CMOS芯片具有兩種類型：全局快門和滾動(dòng)快門。能否選擇正確的芯片會(huì)對(duì)成像質(zhì)量帶來(lái)重大的影響，在目標(biāo)物體會(huì)移動(dòng)時(shí)尤為如此。在滾動(dòng)快門芯片中，像素是逐行進(jìn)行曝光的。因此，在接連的兩行像素采集圖像的間隔時(shí)間內(nèi)，如果物體改變了位置，那么采集到的兩個(gè)像素行就會(huì)產(chǎn)生圖像偏斜的現(xiàn)象，造成圖像的空間結(jié)構(gòu)失真。但是，滾動(dòng)快門芯片有一個(gè)技術(shù)優(yōu)勢(shì)：由于其像素中的電子部件較少，因此在讀取過(guò)程中的噪聲更低。與之不同的是，全局快門芯片會(huì)同時(shí)對(duì)所有像素進(jìn)行曝光。在這種情況下，不同像素行的曝光之間不存在時(shí)間差，因此在物體移動(dòng)時(shí)就不會(huì)導(dǎo)致空間結(jié)構(gòu)失真。

靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍

在仔細(xì)研究圖像的成像質(zhì)量之前，非常重要的一點(diǎn)是要先確保系統(tǒng)有足夠的靈敏度來(lái)采集熒光信號(hào)。根據(jù)不同應(yīng)用的實(shí)際情況，熒光信號(hào)的強(qiáng)度可能非常弱。我們應(yīng)將靈敏度理解為要生成能與噪聲區(qū)分開來(lái)的信號(hào)所需要的最小光量。量子效率(QE)是一個(gè)重要的數(shù)值，它描述來(lái)自光源的入射光子數(shù)量與像素所生成的電子數(shù)量之間的比值。這個(gè)比值取決于波長(zhǎng)，為了獲得最佳效果，特定芯片的光譜應(yīng)與應(yīng)用中熒光基團(tuán)的發(fā)光光譜保持一致。量子效率越高，所產(chǎn)生光子的數(shù)量越多，使得曝光時(shí)間可以相應(yīng)縮短，那么熒光基團(tuán)被光漂白的機(jī)率就越低，并且還可能提高整體的成像速度。

通常，光源具有一系列廣泛的光線強(qiáng)度也是有益處的，這樣通過(guò)一次曝光就能解決問(wèn)題。滿井容量在這里也是密切相關(guān)的，這個(gè)概念描述的是每個(gè)像素曝光一次可以產(chǎn)生的最大電子數(shù)。滿井容量越高，在像素飽和之前可以采集到的光線就更多，從而減少了由于像素飽和而要再次進(jìn)行曝光的情況。

動(dòng)態(tài)范圍則是將產(chǎn)生真實(shí)信號(hào)所需的最大電子數(shù)與最低電子數(shù)相結(jié)合，它描述的是相機(jī)測(cè)量和區(qū)分不同光照等級(jí)的整體能力。

成像質(zhì)量和噪聲

噪聲是指真實(shí)信號(hào)值和測(cè)量系統(tǒng)所產(chǎn)生值之間的偏差。在特定的光照等級(jí)下，信噪比(SNR)可用于量化成像系統(tǒng)的整體噪聲水平，它是一個(gè)用于比較相機(jī)的通用參數(shù)。信噪比越高，成像質(zhì)量就越高。在成像過(guò)程中，某些噪聲類型幾乎很難通過(guò)相機(jī)技術(shù)來(lái)減少，例如光子噪聲/散粒噪聲，因?yàn)樗鼈兪怯晒庾颖旧淼奈锢硇再|(zhì)而引起的。但是，其他會(huì)影響成像質(zhì)量的噪聲類型則會(huì)顯著受到芯片本身和相機(jī)技術(shù)的影響。近年來(lái)，在成像質(zhì)量和性能方面，現(xiàn)代CMOS芯片已經(jīng)超越了以前的CCD技術(shù)。讀取噪聲（或顳暗噪聲）是每次觸發(fā)快門時(shí)加到信號(hào)中的噪聲，用單位“eˉ/像素”來(lái)表示。現(xiàn)代CMOS芯片的讀取噪聲可低至2eˉ/像素。

當(dāng)曝光時(shí)間增加時(shí)，另一個(gè)與熒光應(yīng)用相關(guān)的噪聲源會(huì)變得非常重要，這種噪聲是由暗電流引起的。暗電流是在曝光期間出現(xiàn)的電子泄漏，用單位“eˉ/像素/秒”來(lái)表示。一般而言，暗電流會(huì)隨著溫度每升高7°C而翻倍

散熱

芯片的溫度對(duì)暗電流有至關(guān)重要的影響，會(huì)導(dǎo)致信噪比和成像質(zhì)量變差，在光信號(hào)較弱且曝光時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)尤為如此。這意味著相機(jī)散熱很重要，但這在熒光成像中并非絕對(duì)必要。由于散熱措施對(duì)系統(tǒng)成本有顯著影響，因此大多數(shù)相機(jī)并沒(méi)有采用主動(dòng)散熱措施，這對(duì)于熒光信號(hào)良好的應(yīng)用而言已經(jīng)足夠。但即便如此，這些相機(jī)中的設(shè)計(jì)也會(huì)影響芯片溫度。所以，應(yīng)該通過(guò)低功耗的模式來(lái)操作相機(jī)以避免設(shè)備發(fā)熱。此外，還應(yīng)通過(guò)內(nèi)部硬件設(shè)計(jì)以及將相機(jī)安裝在另一個(gè)散熱載體上來(lái)有效地將熱量傳輸?shù)酵獠俊?

可以使用熱電元件（珀?duì)柼?yīng)）主動(dòng)為芯片散熱，通?？山柚娠L(fēng)扇將珀?duì)柼a(chǎn)生的熱量排散到外部。當(dāng)元件的溫度低于環(huán)境溫度時(shí)，風(fēng)扇還有助于防止出現(xiàn)冷凝水。如果需要避免在系統(tǒng)中出現(xiàn)振動(dòng)（可能由風(fēng)扇引起），某些相機(jī)還可以支持水冷。

總結(jié)

關(guān)于如何正確選擇顯微鏡相機(jī)，這里總結(jié)幾條建議：

1. 第一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是選擇合適的顯微鏡，能夠捕捉你要看的樣品，然后是選擇與之匹配的相機(jī)。如果物鏡的光學(xué)分辨率低于你要觀察的結(jié)構(gòu)，那么任何相機(jī)都幫不上忙。

2. 我們可以根據(jù)傳感器類型來(lái)選擇相機(jī)，但不是唯一的辦法。相機(jī)列出了許多參數(shù)，最重要的三個(gè)參數(shù)是：靈敏度、分辨率和速度，可根據(jù)需求進(jìn)行選擇。選擇分辨率是需要將相機(jī)像元和光學(xué)分辨率進(jìn)行匹配，在匹配的同時(shí)盡量選擇像元較大的相機(jī)。如果你需要進(jìn)行熒光成像，量子效率和讀取噪聲是決定相機(jī)靈敏度的兩個(gè)關(guān)鍵變量。因此，在選購(gòu)時(shí)需要考慮信噪比（SNR）。

3. 在實(shí)際選型中，不同類型的相機(jī)對(duì)制冷的要求也不盡相同：

①. 對(duì)于EMCCD相機(jī)，像素尺寸通常較大（常見的為13-16μm），每個(gè)像素上產(chǎn)生的暗電流本就較多，而且EMCCD中的暗電流還會(huì)和信號(hào)一起被增益放大，所以用制冷壓制EMCCD相機(jī)的暗電流產(chǎn)生尤其重要。因?yàn)檫@些原因，主流的EMCCD相機(jī)制冷溫度都在-50℃以下。

②. 而對(duì)于sCMOS相機(jī)，不僅像素尺寸會(huì)較小一些，也沒(méi)有額外的增益，所以對(duì)制冷的要求就相對(duì)低一點(diǎn)。

4. 在信號(hào)較弱的熒光成像中，來(lái)自信號(hào)的散粒噪聲較??；而暗電流的散粒噪聲（即暗噪聲）在當(dāng)前的高端科研相機(jī)都是很低的，在曝光時(shí)間1s這個(gè)量級(jí)甚至更短的時(shí)候，暗噪聲通?？梢院雎裕淮藭r(shí)讀出噪聲就成為特別需要考量的因素了。對(duì)于同樣的芯片，讀出噪聲的大小與讀出速度有關(guān)，無(wú)論對(duì)于CCD相機(jī)還是sCMOS相機(jī)，讀出速度越快，讀出噪聲越高。而sCMOS相對(duì)于CCD的一個(gè)核心優(yōu)勢(shì)，就是高速讀出時(shí)依然能夠保持極低的讀出噪聲。

案例

近期華中某國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室需要一臺(tái)倒置熒光顯微鏡，我們工程師了解到客戶主要用于拍攝細(xì)胞，偶爾也會(huì)用來(lái)拍攝組織染色切片，細(xì)胞具體熒光都是比較常用的染料，熒光也比較亮，不需要長(zhǎng)時(shí)間曝光，所有倍數(shù)均有拍照需求，我們工程師綜合客戶的需求推薦了浩康生物倒置熒光顯微鏡HIF2000+高分辨率熒光顯微鏡相機(jī)HS2000E配置的高性價(jià)比方案，HS2000E采用sCMOS芯片，相比CCD具有更低的讀出噪聲和更高的性價(jià)比，經(jīng)過(guò)試用該配置方案完全滿足客戶需求，并贏得了客戶的認(rèn)可。

熒光顯微鏡相機(jī)HS2000E

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