40多年來，秀麗隱桿線蟲一直被用作神經(jīng)科學(xué)、發(fā)育和分子生物學(xué)以及遺傳學(xué)的模式生物。它是第一個(gè)對(duì)其整個(gè)基因組進(jìn)行測序的多細(xì)胞生物，并且直到現(xiàn)在，它也是世界上唯一被完整繪制出神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的生物。秀麗隱桿線蟲中的大量基因可以以與哺乳動(dòng)物相似的方式發(fā)揮作用。秀麗隱桿線蟲基因組中大約 1/3 的基因與某些人類基因同源，因此，該線蟲可用作研究人類相關(guān)疾病的模式生物。線蟲在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)非常容易和快速，通常保持在略低于室溫 (15–20 °C) 的溫度。成蟲長約 1 毫米，直徑小于 75 微米。它們保存在瓊脂平板上，即培養(yǎng)皿內(nèi)的瓊脂凝膠，以細(xì)菌（大腸桿菌）為食物。

線蟲的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室工作有幾個(gè)常見步驟：
1. 挑選線蟲；
2. a） 轉(zhuǎn)基因：將轉(zhuǎn)基因顯微注射到線蟲中以修改其基因組；b） RNA干擾（RNAi）：將雙鏈（ds）RNA引入線蟲以抑制基因表達(dá)；
3. 篩選：評(píng)估線蟲以檢測成功的 RNAi 或轉(zhuǎn)基因；
4. 用各種方法研究線蟲的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)；
5. 線蟲的記錄或功能成像，通常使用共聚焦或復(fù)合顯微鏡完成。

首先，必須選擇和挑選線蟲，然后是基因或蛋白質(zhì)表達(dá)的操作，然后是一段時(shí)間的線蟲繁殖。然后根據(jù)表型區(qū)分線蟲，以找到對(duì)應(yīng)特征的線蟲。如果這些線蟲太少，可能會(huì)重復(fù)前面的步驟。當(dāng)有足夠數(shù)量的具有感興趣特征的線蟲時(shí)，它們將被再次挑選、固定，最后進(jìn)行功能成像。上面顯示的工作步驟不一定按序號(hào)順序完成。

一般線蟲培養(yǎng)、挑選、篩選蟲等時(shí)需要考慮的幾點(diǎn)：
a. 每個(gè)平板中的瓊脂量相同（高度相同）保證更換瓊脂平板時(shí)避免重新聚焦；
b. 瓊脂上的細(xì)菌（食物）濃度更低保證獲得更清晰的線蟲顯微鏡圖像
c. 具有薄瓊脂層且無蛋白胨可減少線蟲成像板的熒光背景（自發(fā)熒光）
d. 良好的對(duì)比度對(duì)透射光可將線蟲與瓊脂區(qū)分開來
e. 良好的熒光信噪比 (S/N) 和暗背景可檢測更微弱的熒光信號(hào)以獲得更好的圖像結(jié)果
f. 當(dāng)以更高的總放大倍數(shù)（60 倍以上）對(duì)線蟲成像時(shí)，確保良好的對(duì)比度和高分辨率。

在挑選合適的線蟲并準(zhǔn)備它們進(jìn)行遺傳或生化分析時(shí)，通常使用體視顯微鏡選擇線蟲并用小鉑絲或睫毛挑選。然后，為了通過顯微注射在線蟲的性腺中進(jìn)行基因改造，將它們放置在載玻片上的一個(gè)小的干燥瓊脂墊上。

明場中的線蟲篩查

使用多個(gè)體視顯微鏡可以實(shí)現(xiàn)對(duì)線蟲的有效篩選以提高數(shù)量。 配備燈架或小型照明底座的浩康生物HZ6100常規(guī)體視顯微鏡非常適用于線蟲篩查。當(dāng)與輔助物鏡一起使用時(shí)，它可以實(shí)現(xiàn)更高的放大倍率和分辨率。由于其緊湊的設(shè)計(jì)，HZ6100在實(shí)驗(yàn)室中占用的空間也更少。 使用這些顯微鏡可以輕松制作具有高對(duì)比度的線蟲圖像，即使在低放大倍率下也是如此。對(duì)于教學(xué)人員來說，它們也是特別好的解決方案。

下面列出了在使用HZ6100在明場中進(jìn)行線蟲篩查的不同優(yōu)勢。
★由于有足夠的空間同時(shí)容納多個(gè)瓊脂平板，因此簡化了標(biāo)本處理，最大限度地減少了平板意外掉落的可能性；
★用于取蟲、顯微注射等操作，有足夠的空間讓用戶的手在物鏡周圍和下方工作；
★學(xué)生課程的干凈設(shè)置，因?yàn)闆]有外部燈、電纜，也沒有可能從底座上掉下來的設(shè)備；
★由于居中 LED，標(biāo)本成像具有良好的對(duì)比度和均勻的照明；
★不使用時(shí)易于存放，因?yàn)檎麄€(gè)顯微鏡裝置很容易放在壁櫥架子上。

浩康生物 HZ7100體視顯微鏡也可以實(shí)現(xiàn)高效的線蟲篩查。 HZ7100有一個(gè)共同的主物鏡 (CMO)，因此沒有傾斜的焦平面，雙眼的整個(gè)視野都清晰對(duì)焦。 此外，該系統(tǒng)是模塊化的，允許您非常快速地靈活添加、交換或更換組件。如果需要多個(gè)用戶同時(shí)觀察標(biāo)本圖像，并記錄高分辨率圖像以供報(bào)告，則可以安裝數(shù)碼相機(jī)。例如，具有630萬或更多像素的相機(jī)HS600E/HS2000E可以生成高清 (HD) 實(shí)時(shí)圖像和錄制圖像。

轉(zhuǎn)基因、顯微注射和 RNAi

有一些方法可以改變線蟲的基因/蛋白質(zhì)表達(dá)。通過對(duì)線蟲進(jìn)行顯微注射來進(jìn)行穩(wěn)定和瞬時(shí)的基因修飾。 兩種主要方法是：轉(zhuǎn)座子，也稱為跳躍基因，或CRISPR/Cas9系統(tǒng)。CRISPR 的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)量較低，需要一個(gè)世代周期進(jìn)行選擇，但轉(zhuǎn)基因插入更穩(wěn)定。轉(zhuǎn)座子方法效率更高，產(chǎn)量更高，需要注射的線蟲更少，但轉(zhuǎn)基因整合到基因組中的位置并不總是很清楚。

一旦將線蟲放在載玻片上的干瓊脂墊上，重要的是要快速工作，否則線蟲可能會(huì)在操作過程中干燥并死亡。為了減緩線蟲的干燥，通常它會(huì)被油覆蓋，例如鹵化碳或石蠟。通常，顯微注射應(yīng)在 5 分鐘內(nèi)完成。將帶有瓊脂墊的載玻片放在倒置顯微鏡的載物臺(tái)上，找到一條線蟲，并將轉(zhuǎn)基因 (DNA) 注入遠(yuǎn)端性腺。

然后用恢復(fù)緩沖液覆蓋線蟲，用鉑絲或睫毛挑起并放置在單獨(dú)的瓊脂板上進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)和繁殖。此工作步驟通常在配備微分干涉對(duì)比 (DIC) 或集成調(diào)制對(duì)比 (IMC) 照明的手動(dòng)倒置熒光顯微鏡上執(zhí)行，例如 Leica DMi8或浩康生物HIF2000。強(qiáng)烈建議在顯微鏡下設(shè)置抗震裝置以獲得更高的產(chǎn)量。

對(duì)于顯微注射針的精確定位，使用高精度3軸油機(jī)械手是實(shí)用的，例如來自 Narishige Instruments 的機(jī)械手

RNA 干擾 (RNAi) 用于在翻譯水平上改變蛋白質(zhì)表達(dá)。它是通過用表達(dá)雙鏈 (ds) RNA 的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌喂養(yǎng)線蟲來實(shí)現(xiàn)的。線蟲攝取 dsRNA，它進(jìn)入線蟲的所有細(xì)胞（神經(jīng)元除外），經(jīng)過細(xì)胞生化處理，然后產(chǎn)生短干擾 (si) RNA。一旦存在于細(xì)胞中，siRNA 就會(huì)改變蛋白質(zhì)表達(dá)。

轉(zhuǎn)基因線蟲育種及熒光篩選

顯微注射后，線蟲進(jìn)一步培養(yǎng)，下一代用于實(shí)驗(yàn)。線蟲保持在 20°C 以進(jìn)行繁殖。必須避免線蟲干燥，因此瓊脂平板通常存放在塑料盒中。要獲得大量的線蟲，第二種可能是在錐形瓶中進(jìn)行液體培養(yǎng)。

大約5條線蟲足以進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析（識(shí)別蛋白質(zhì)）。然而，差分梯度離心需要 10萬條線蟲才能按密度分離細(xì)胞器和蛋白質(zhì)。

由于轉(zhuǎn)基因通常與綠色熒光蛋白 (GFP)結(jié)合，因此可以使用熒光體視顯微鏡對(duì)其進(jìn)行選擇。其他熒光標(biāo)記如 DsRed在高表達(dá)水平下可能有毒，因此通常選擇 GFP 標(biāo)記。

使用明場定位線蟲，檢查熒光信號(hào)，然后挑選進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)。對(duì)于成像，通常首選較年輕的線蟲，因?yàn)檩^老的線蟲通常表現(xiàn)出更高的自發(fā)熒光，尤其是在腸道中。將選定的線蟲放在特殊的小瓊脂板上，不含蛋白胨和細(xì)菌，以最大限度地減少自發(fā)熒光。瓊脂層通常非常薄以進(jìn)一步減少自發(fā)熒光。使用浩康生物HZF7000/HZFX800體視熒光顯微鏡，可以對(duì)線蟲進(jìn)行高效熒光篩查。

熒光篩查的重要考慮因素
★為了獲得最高的對(duì)比度和分辨率，選擇合適的底座；
★選擇很少產(chǎn)生或沒有熒光成像的背景光“噪音”的底座；
★使用帶有雙面鏡凹面的底座時(shí)，在高倍率下可獲得更好的對(duì)比度和更高分辨率的圖像。
★使用帶有外部光源的底座時(shí)，避免在不需要時(shí)加熱線蟲。
★對(duì)于高自發(fā)熒光的情況，降低熒光激發(fā)強(qiáng)度會(huì)增加信噪比。在許多情況下，來自線蟲的熒光信號(hào)是最大的，并且不能增加更多，但背景總是可以。

功能成像
正置共聚焦和熒光顯微鏡，例如HF3000正置熒光顯微鏡，通常用于線蟲的成像和記錄以獲得亞細(xì)胞的高分辨率圖像和大分子結(jié)構(gòu)。

對(duì)于共聚焦成像，線蟲表達(dá)熒光蛋白，即 GFP、紅色熒光蛋白（RFP、mCherry 或 DsRed）、黃色熒光蛋白（YFP）或青色熒光蛋白（CFP）。

線蟲位于板中瓊脂層的頂部需要正置共聚焦和熒光顯微鏡。線蟲移動(dòng)相對(duì)較快，所以它們通常被藥物L(fēng)evamisol麻醉，然后將蓋玻片放在它們上面，以便通過液浸物鏡進(jìn)行觀察。幼蟲階段的幼蟲對(duì)光非常敏感，因此使用共聚焦共振掃描儀，由于停留時(shí)間短，可以將光毒性問題降至最低。共振掃描儀允許對(duì)線蟲幼蟲進(jìn)行長期觀察，而不會(huì)造成明顯的損壞

總結(jié)

線蟲的常用方法涉及使用體視顯微鏡和熒光顯微鏡等多個(gè)工作步驟。線蟲實(shí)驗(yàn)室的需求可能會(huì)有所不同，可以使用多種儀器配置來解決工作步驟中的特定任務(wù)

以下是常用顯微鏡解決方案的列表:
一、線蟲挑選通常使用普通體視顯微鏡（如浩康生物HZ6100）進(jìn)行，使用產(chǎn)生高對(duì)比度的透射光底座；
二、轉(zhuǎn)基因顯微注射是通過倒置熒光顯微鏡（如浩康生物HF3000）實(shí)現(xiàn)的，使用顯微操縱器定位針頭和 DNA 注射器；
三、熒光篩選可以使用體視熒光顯微鏡（如浩康生物HZF7100 或 HZFX800）；
四、使用透射光底座實(shí)現(xiàn)非常好的對(duì)比度；
五、明場篩選通常使用普通主物鏡 (CMO) 體視顯微鏡進(jìn)行（如浩康生物 HZ7100）；
六、功能成像，即用于細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、衰老、神經(jīng)元活動(dòng)等研究的轉(zhuǎn)基因線蟲的表征，是通過正置熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡完成的；
七、固定的線蟲也可以使用更高性能的熒光體視顯微鏡（如浩康生物 HZF7100）和透射光底座；為了對(duì)線蟲胚胎進(jìn)行成像，建議使用共焦共振掃描儀以實(shí)現(xiàn)低光毒性；對(duì)于教室、教學(xué)實(shí)驗(yàn)室和培訓(xùn)，顯微鏡設(shè)置要求可能與研究實(shí)驗(yàn)室不同。

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