一、什么是相差顯微鏡

相差顯微鏡是常見的一種顯微鏡，在很多實驗室中都可以見到，利用光線穿過透明樣品時產生的相位差轉換為圖像中的振幅或對比度差的原理，主要是用來觀察細菌，細胞等細胞結構的透明樣品。因為它可以在自然狀態(tài)下檢查活細胞，而無需事先對細胞殺死、固定和染色的優(yōu)點，相差顯微鏡可以高清晰度和高對比度地觀察和記錄動態(tài)的生物過程，可以用來進行細胞周期等方向的研究。

相差顯微鏡的出現得益于相襯顯微技術的發(fā)明，相襯顯微技術是顯微技術的中的一個重大進步，它的發(fā)明人澤尼克也因此獲得了1953年的諾貝爾物理學獎。

二、相差顯微鏡的原理

相差顯微鏡的核心是一個位于聚光鏡孔徑光闌位置的相差環(huán)板和位于物鏡后方的相位板。首先光線從照明用的燈絲內的一點射出，由場透鏡精確的聚焦在聚光鏡處的相差環(huán)板的開放處。由于這個位置處在聚光鏡的前焦平面，光線在通過聚光鏡后將變成平行光。假設這兩束光線在標本處不發(fā)生衍射，它們將平行的射入物鏡，所有的平行光都會聚焦在物鏡后方的相位板上。但實際上，部分光線通過標本以后部分光線將會發(fā)生衍射，為了完成調整相位的需求，需要調整物鏡后方的相位板即可。相位板的另一個作用是將未被標本影響的光線減弱，用對中望遠鏡觀察物鏡后方的相位板，可見減光材料形成的暗環(huán)。

物鏡后方的相位板由共軛面和補償面組成，共軛面為環(huán)狀，是直射光通過部分，通常涂有吸收光線的物質，補償面位于共軛面的內外兩側部分，是通過衍射光的部分。

光線通過相差環(huán)板射入，通過聚光鏡射出后形成平行的波陣面。當這些平面波碰到樣本的時候，一些光在穿過標本時發(fā)生衍射，改變了它們和直射光之間的相位關系，新產生的球面波在從標本射出后相位將被延遲λ/4。注意到現在有兩種類型的波，直射光和衍射光，它們之間存在λ/4的相差。在正相襯中，共軛面只鍍有吸收膜，補償面則鍍有相位膜，這樣直射光A僅被吸收，振幅減少，相位未被推遲；而衍射光B的相位則被延遲λ/4，使其與直射光的相位相差λ/2（λ/4+λ/4），在中間相平面上的合成波C的振幅等于兩波振幅的差（引起相消干涉），這時樣本要比背景暗（因為背景只有直射光，被吸收，振幅減少），這就是正相襯的效果。

相反在負相襯中，由于相位板的共軛面不僅鍍有吸收膜，而且還鍍有相位膜，除了吸收直射光使其振幅減小外，而且也把直射光的相位延遲λ/4，這樣使直射光A與衍射光B維持同一相位，則合成波C等于直射波與衍射波振幅的和（引起相長干涉），因背景只有直射光的照明，而樣本則比背景明亮。

這樣就通過相差顯微鏡改變直射光或衍射光的相位，把人眼無法鑒別的相位差變成了眼睛能測量到達視網膜的光線能量強度振幅差（明暗差），在觀察細胞的時候也就不會對細胞標本產生傷害。

三、相差顯微鏡的優(yōu)勢

相差顯微鏡可以觀察未經染色的活細胞等樣品，相對于其它對比增強技術，如DIC，相差顯微鏡不使用偏振光照明，因而可以觀察雙折射介質，如透過塑料培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿進行活細胞觀察，可以清楚觀察到樣品的內部結構（如細胞核），這在細胞學研究上特別有用。如和落射熒光技術連用，相差物鏡可以透過約70%的激發(fā)光，優(yōu)于DIC，所以相差往往作為輔助成像功能應用在熒光顯微鏡上。此外，相差套件的采購價位相對較低，使用調校也較為簡單。

但是相襯顯微技術存在一些固有的不足。由于必須使用環(huán)形光闌，啟用相襯照明時聚光鏡的數值孔徑有所限制，所以相襯成像的軸向分辨率較低。另外，標本和背景折射率差異較大的分界處會出現明顯的光暈，導致如細胞膜、細胞器外緣等位置的細節(jié)被遮蔽。

四、相差顯微鏡的應用

相差顯微鏡主要用于對透明標本的高對比度成像，如活細胞（通常在培養(yǎng)基中）、薄組織切片、光刻圖案、纖維、乳膠分散體、玻璃碎片和亞細胞顆粒（包括細胞核和其他細胞器）。

另外相差顯微鏡廣泛應用于臨床中，新鮮液體標本中細胞和微生物的檢查,尤其適用于活細胞檢查。一般是取新鮮液體標本,加上蓋玻片(如用油鏡時,還需在蓋玻片上滴加鏡油)立即進行檢驗。如：血液學檢驗中用于血小板計數、血液中寄生蟲檢查和某些活細胞觀察等；微生物學檢驗中用于不染色或染不上色的細菌、螺旋體、真菌孢子等的快速辨認,特別是對具有鞭毛、莢膜等特殊形態(tài)微生物的鑒別，還有尿分析中用于辨認新鮮尿中各種細胞和管型,特別是透明管型、白細胞、腎小管上皮細胞以及紅細胞形態(tài)的分類等。

五、相差顯微鏡的使用方法

1.打開顯微鏡明場電源開關（“︱”為開，“O”為關）
2.將樣品置于載物臺上
3.將顯微鏡光路調至目鏡觀察位置
4.從低倍鏡開始觀察，調節(jié)到與鏡頭相匹配的相差環(huán)，熒光濾塊調到空檔的位置
5.調節(jié)透射光光強，調節(jié)焦距，找到預觀察視野
6.依次換到高倍鏡，（注意調節(jié)相差環(huán)）觀察樣品
7.拍照時將光路選擇調至相機拍攝位置

注意：
1. 光源亮度和孔徑光闌應適當調大，因為相差環(huán)板和相位板遮掉大部分光源；
2. 樣品不能太厚，以5-10ｕｍ左右為宜，否則將影響成像質量；
3. 選取高品質載玻片和蓋玻片，厚度等應符合標準；
4. 安裝時應把每個相差環(huán)調節(jié)到最佳狀態(tài)。

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